操作过程：1.从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩下板条用自封袋密封放回 4℃。2. 设置品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同浓度的品 50μL；3. 待测样本孔先加待测样本 10μL，再加样本稀释液 40μL；4. 随后品孔和样本孔中（空白孔不加）参加辣根过氧化物酶（HRP）符号的检测 50μL，用封板膜封住反响孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。5. 弃去，吸水纸上拍干，每孔加满洗刷液，静置 1min，甩去洗刷液，吸水纸上拍干，如此重复洗 板 5 次（也可用洗板机洗板）。6. 一切孔参加底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 一切孔参加停止液 50μL，15min 内，在 450nm 波利益测定各孔的 OD 值。

  成果判别： 制作曲线：在Excel作业表中，以品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，制作出品线性回归曲线，按曲线方程核算各样本浓度值。

  试验开端前，请提早装备好一切试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽可能的防止起泡。每次检测都应该做曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品契合试剂盒的检测规模。

  1.加样：别离设空白孔、孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔别离加品或待测样品100μl，留意别有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，悄悄晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反响120分钟。 为试验成果有效性，每次试验请运用新的品溶液。

  2.弃去，甩干，不必洗刷。每孔加生物素符号作业液 100μl（取1μl生物素符号加99μl生物素符号稀释液的份额制造，悄悄混匀，在运用小时内制造），37℃,60分钟。

  3.温育60分钟后，弃去孔内，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

  4.每孔加辣根过氧化物酶符号亲和素作业液（同生物素符号作业液） 100μl，37℃，60分钟。

  5.温育60分钟后，弃去孔内，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

  6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此刻可见品的前3-4孔有显着的梯度蓝色，后3-4孔梯度不显着，即可停止）。

  7.依序每孔加停止溶液50μl，停止反响（此刻蓝色立转）。停止液的参加次序应尽量与底物液的参加次序相同。为了试验成果的精确性，底物反响时间到后应赶快参加停止液。

  8.用酶联仪在450nm波长依序丈量各孔的光密度（OD值）。在加停止液后15分钟以内进行检测。

  ：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。

  ：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本收集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。

  ：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应防止重复冻融。 (注：标本溶血会影响**检测成果，因而溶血标本不宜进行此项检测。)

  ：经过文献检索的了解待测样本的大致含量，确认恰当的稀释倍数。只要稀释至曲线的规模内，检测的成果才是精确的。稀释的中，应做好具体的记载。核算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。

  ：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后重复倒置/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，别离稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为浓度0 pg/ml，临用前15分钟内制造。 如制造150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品参加含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其他浓度以此类推。

  ：临用前以生物素符号稀释液稀释，稀释前依据预先核算好的每次试验所需的总量制造（每孔100μl），实践制造时应多制造0.1-0.2ml。如10μl生物素符号加990μl生物素符号稀释液的份额制造，悄悄混匀，在运用小时内制造。

  ：临用前以辣根过氧化物酶符号亲和素稀释液稀释，稀释前依据预先核算好的每次试验所需的总量制造（每孔100μl），实践制造时应多制造0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶符号亲和素加990μl辣根过氧化物酶符号亲和素稀释液 的份额制造，悄悄混匀，在运用小时内装备

  双夹心：本法大多数都用在检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病（IBDV）的双夹心ELISA为例介绍本法的操作程序。① 加包被 → 4℃过夜，洗刷三次、抛干② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗刷三次、抛干③ 加酶标 → 37℃ 30分钟，洗刷三次、抛干④ 加底物液→ 37℃ 15分钟，加停止液⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

  以物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（一般坐标），在半对数坐标纸上绘出曲线，依据样品的OD值由曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用物的浓度与OD值核算出曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，核算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实践浓度。

  制作曲线：在Excel作业表中，以品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，制作出品线性回归曲线，按曲线方程核算各样本浓度值。

  4.请每次测定的一起做曲线.如标本中待测含量过高，请先稀释后再测定，核算时请乘以稀释倍数。