肿瘤已成为威胁人类生命的一大杀手，目前主要是采用手术和放、化疗等手段进行及时有效的治疗，但由于放、化疗的细胞选择性差、毒副作用明显且易引起肿瘤细胞产生耐受（/药）性，不利于肿瘤的持续治疗，因此亟待研发具有定向定位优势、毒副作用低的新型靶向药物. 原位自组装多肽能识别肿瘤部位的特异性高表达物质，在肿瘤部位靶向性聚集形成稳定的纳米结构，实现精准和高效治疗，有望成为一种新型的抗肿瘤药物. 本研究基于多肽原位自组装的设计理念，利用溶酶体内组织蛋白酶L的催化活性，设计了靶向溶酶体且能够原位自组装的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，研究了该分子的自组装特性及抗肿瘤活性. 结果为，在体外酸性条件下，组织蛋白酶L能精准切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子，其酶切产物Fmoc-FFR-OH自组装形成长纳米纤维结构，对肿瘤细胞A375和SH-SY5Y均具备比较好的杀伤作用. 该分子通过靶向溶酶体杀伤肿瘤细胞且对正常细胞的毒性较低，有望成为一种新型的抗肿瘤药物.

　　肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已严重威胁人类健康［1］. 目前肿瘤治疗主要使用手术和放、化疗，但放、化疗通常毒副作用明显、细胞选择性差且易导致肿瘤细胞产生耐受（/药）性，不利于肿瘤的持续治疗. 因此亟待研发具有靶向性且毒副作用小的新型抗肿瘤药物. 抗肿瘤多肽因其活性高、毒性低且不易引起细胞产生非特异性免疫反应等优点，展现出良好的应用前景. 然而，普通抗肿瘤多肽存在生物体内的作用机制不明确、稳定性差等问题，性能还需进一步提升.

　　多肽自组装是多肽分子自发聚集形成有序结构（如纳米球、纳米管、纳米棒等）的过程，通过该过程，一方面能够提升多肽分子的稳定性；另一方面，可赋予其特殊的生物学功能，如药物控释、细胞培养、组织工程支架等［2］. 一些具有特定形貌的多肽自组装结构也表现出优良的抗肿瘤活性［3-6］，如Chen等［4］发现，CL-1多肽在组装后对含有磷酯酰丝氨酸的磷脂膜具有较大的破坏作用，具备比较好的抗肿瘤活性. KLVFF-交联的透明质酸纳米纤维，表现出较好的抗胸腺癌细胞的发展和转移性能［3］. 前期研究中，我们也发现短肽分子A9K形成的纳米短棒能破坏肿瘤细胞的细胞膜，快速杀死肿瘤细胞［5-6］. 多肽分子的组装过程主要依赖于分子内/间各基团的静电吸引、疏水作用、氢键以及范德华力等非共价作用力共同驱动，组装过程容易受到外界环境（如pH、温度、光照、离子强度等）的影响，因此导致组装体微观形貌或材料宏观性质发生改变. 基于此，科学家提出了“肽原位自组装”的概念，即具有靶向性的前体肽分子在体内特定靶点部位高效聚集，并在该部位特异性高表达的物质诱导下，自组装形成特定形貌的组装体结构［7-8］，从而行使特殊的生物学功能. 在不同肿瘤组织中，碱性磷酸酶、酪氨酸酶、基质金属蛋白酶等生物酶的表达量增加，特定序列的多肽分子可在上述酶的催化作用下组装形成特定形貌的纳米结构，杀死肿瘤细胞［9-13］，在肿瘤的精准定位和靶向治疗方面展现出广阔的应用前景.

　　溶酶体在分子伴侣热休克蛋白70（heat shock cognate protein，HSC70）的参与下调控细胞内自噬，在肿瘤的发生和发展过程中扮演重要角色［14-15］. HSC70可识别含有KFERQ序列的蛋白质和多肽底物，并与溶酶体膜上的受体结合，介导底物进入溶酶体进行降解［16］. 溶酶体中含有多种水解酶，其中组织蛋白酶L（cathepsin L）是一种普遍表达的半胱氨酸蛋白酶，在降解多种生理蛋白底物方面具有较高的特异性［17］，能调控肿瘤细胞的生长［18］. 根据Schechter—Berger命名法，将酶切位点定义为P位点，其酶切序列为...P3-P2-P1-P1′-P2′-P3′...［19］，当水解蛋白质分子时，底物序列中的P2位点决定了cathepsin L的酶切特异性，一般其P2位为含有苯环的氨基酸时，cathepsin L的酶切效率较高［20］；同时当P1位点为精氨酸（arginine，R），P2和P3位点为疏水性氨基酸残基时，其酶切效率也能极大的提升［21］. 通过溶酶体内组织蛋白酶水解产生的氨基酸残基可被肿瘤细胞利用，进行快速分裂增殖，因此可经过控制溶酶体的活性来达到抗肿瘤的目的［22］.

　　本研究利用肿瘤细胞内溶酶体数量较多的微环境，基于多肽原位自组装的设计理念，将溶酶体靶向序列与自组装超短肽序列结合，设计了包含cathepsin L酶切位点的短肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，目的是使该分子既能靶向溶酶体，又能利用溶酶体内cathepsin L的催化作用原位组装形成新的组装体结构，选择性杀伤肿瘤细胞. 通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）等仪器考察cathepsin L酶切前后肽分子质量及组装体微观形貌的改变，并通过MTT法以及流式细胞仪等考察多肽对L929、A375及SH-SY5Y的细胞毒性. 根据结果得出，在体外酸性条件下，cathepsin L能够精准切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子，其酶切产物Fmoc-FFR-OH能在酸性环境中自组装形成长纤维结构，对肿瘤细胞A375以及SH-SY5Y均具备比较好的杀伤作用. 该分子序列短、合成方便，能通过靶向溶酶体并在溶酶体酶的催化下原位组装的机理杀伤肿瘤细胞，且对正常细胞的毒性较低，有望成为一种新型的抗肿瘤药物.

　　多肽合成所需要的氨基酸、树脂、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）等；合成多肽所需溶剂如N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、二异丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）等购自博迈杰生物科技有限公司（珠海）；哌啶（piperidine）、购自西陇化工（上海）、乙腈购自Merck公司（美国）. Cathepsin L（来源于人肝脏，酶活≥0.5 U/mg）、1，4-二硫苏糖醇（DTT）、 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT）购自Sigma-Aldrich公司（美国）；胰酶（trypsin）购自USA Xiasi Bio公司（美国）；Lyso-Tracker Red （溶酶体红色荧光探针）购自碧云天生物技术有限公司（上海）；胎牛血清（FBS）购自四季青生物工程材料有限公司（杭州）；青链霉素购自瑞阳制药有限公司（山东）；DMEM培养基购自Gibco公司（美国）；RPMI-1640培养基购自吉诺生物医药技术有限公司（山东）；其他生化试剂均购自国药集团（上海）.

　　小鼠成纤维细胞（L929）、人神经胶质瘤细胞（SH-SY5Y）、人恶性黑色素瘤细胞（A375）均购自中国科学院上海细胞库. 其中SH-SY5Y 细胞用含10%FBS、1%青链霉素的RPMI-1640培养基在37oC、5% CO2细胞培养箱中培养. L929、A375细胞用含10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基在37oC、5% CO2细胞培养箱中培养.

　　本实验中使用的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH、Fmoc-FFR-OH采用Fmoc固相合成法，利用微波辅助多肽合成仪（Liberty 1型CEM公司，美国）合成. 多肽分子合成是由C端至N端进行，每连接一个氨基酸就执行一次脱保护、活化、缩合步骤. 样品合成结束后，连有多肽分子的树脂在裂解液（95%（v/v）TFA、2.5%（v/v）超纯水、2.5%（v/v）TIS）中室温搅拌. 裂解产物再次抽滤，液体旋转蒸发，冰沉淀，采用清洗多次沉淀后冷冻干燥，即可得到多肽固体粉末. 多肽产品的纯度采用MALDI-TOF-MS和C18反向-高效液相（reverse phase-high performance liquid chromatography， RP-HPLC）的办法来进行鉴定.

　　称取0.3735 mg Fmoc-FFRIKFERQ-OH多肽粉末，溶解在Hepes缓冲液中，溶液配制后需涡旋均匀并放入超声波清洗器内超声使其充分溶解. 若超声30 min后多肽分子仍未完全溶解，可继续85℃水浴加热2 h以促其溶解. 对于AFM实验所用样品，在室温下放置7 d后进行扫描，以保证多肽分子可充分自组装.

　　MALDI-TOF-MS （Microflex型Bruker公司，德国）用来检测多肽酶切反应前后分子质量的改变. 实验所用基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，Bruker）的TA30饱和溶液（由30% （v/v）乙腈、70%（v/v）0.1%TFA水溶液配制而成）. 分别取基质上清液2.5 μl和样品2.5 μl混合均匀，取2.5 μl混合均匀后的样品点于靶板上，放置于通风橱中至样品自然干燥. 实验中采用延时引出和正离子反射模式检测，激光波长337 nm，加速电压19.0 kV，反射电压20.0 kV，延时引出时间140 ns，激光频率60 Hz，累加450次单次扫描结果作为质谱图.

　　AFM（Nanoscope Iva型Nanoscope Iva公司，美国）是通过检验测试待测样品和微悬臂的原子间相互作用力来表征组装体的形貌. 本实验采用剥离的新鲜云母片表面作为基底，在上面滴加10 μl待测样品，吸附约30 s后，用少量超纯水冲洗云母片，并用氮气吹干. 本实验扫描过程中采用轻敲模式（tapping mode），扫描频率1 Hz，扫描角度0°，扫描分辨率为512×512. 采用TESP-V2型单晶硅探针（Bruker），针尖半径不大于10 nm，悬臂约 127 μm，胡克系数为42 N/m.

　　采用MTT法检测多肽对细胞增殖率的影响. 首先按1×104 cells/孔将L929、SH-SY5Y、A375细胞接入96孔细胞培养板，置于5% CO2培养箱37oC培养24 h后，加入配制好的多肽溶液. 加入培养基的孔作为对照组，设立相应培养基但无细胞组作为空白组，每组设置6个孔重复，配制好的96孔细胞培养板放置于5% CO2培养箱中培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，4 h后弃除各孔中的全部液体，加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡 10 min后置于酶标仪（Spectra Max M2e型Molecular Devices公司，美国）中检测490 nm处的吸光度（A490） 值，实验至少重复3次以上. 根据下列公式计算细胞相对增殖率：

　　采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）以及荧光染色检测溶酶体膜结构的变化. Lyso-Tracker Red是一种溶酶体红色荧光探针，能通透细胞膜，可用于活细胞溶酶体特异性荧光染色. 按1×104 cell/孔接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，加入配制好的多肽溶液在5% CO2培养箱中培养48 h，然后收集细胞，去除细胞培养液，加入37℃预温育的Lyso-Tracker Red染色液，与37℃孵育细胞40 min. 随后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重悬细胞，使用流式细胞仪（FACSCalibur型BD公司，美国）进行仔细的检测.

　　荧光染色实验同样使用Lyso-Tracker Red进行检测，按1×104 cell/孔接入96孔细胞培养板，培养24 h后，加入配制好的多肽溶液于5% CO2培养箱中培养48 h. 然后去除细胞培养液，采用PBS洗涤3次，加入37℃预温育的Lyso-Tracker Red染色液，与37℃孵育细胞40 min. 弃去上清液，采用PBS清洗3遍，使用倒置荧光显微镜（DMI300B型Leica公司，德国）进行检测.

　　溶酶体可通过膜受体介导细胞自噬过程，引发细胞死亡，因此在肿瘤的发生和发展过程中扮演重要的角色［14-15］. 进入溶酶体降解的蛋白质分子具有一定的选择性，一般含有KFERQ序列的蛋白质分子能与溶酶体膜受体结合，进入溶酶体内部［16］. 因此，在我们的研究中，采用KFERQ序列作为抗肿瘤肽的溶酶体靶向序列. 为使进入溶酶体的多肽分子能在溶酶体内组织蛋白酶的催化下进行原位自组装，在靶向肽的N端加入具有较强自组装能力的超短肽Fmoc-FF序列［25］. 为使设计的分子具有溶酶体cathepsin L响应性，在Fmoc-FF以及KFERQ两个片段之间插入酶敏感性序列R↓I，设计序列为Fmoc-FFRIKFERQ-OH的多肽. 在该序列中，P1位点为亲水性的R残基，P2位点为含苯环的疏水性氨基酸，该设计能使cathepsin L的酶切效率较高且特异性较强［20-21］. 为验证酶切产物的组装性能，我们还合成了Fmoc-FFR-OH多肽.

　　通过MALDI-TOF-MS实验分析，Fmoc-FFRIKFERQ-OH和Fmoc-FFR-OH多肽的相对分子质量分别为1 495.0（［M+H］+）和692.5（［M+H］+），与理论计算的相对分子质量（1 493.7和690.7）吻合（图1a，b），同时，RP-HPLC实验结果为，合成的多肽RP-HPLC谱图中只有尖锐的单峰出现，对其峰面积积分可知多肽纯度达到98%（图1c，d），符合后续实验要求.

　　分别用pH 5.5、pH 7.2超纯水配制5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH和5 mmol/L Fmoc-FFR-OH溶液，室温下放置7 d使其充分自组装，采用AFM检测上述多肽的组装形貌. 结果为，在酸性和中性条件下，Fmoc-FFRIKFERQ-OH均组装成短棒状纳米结构（图3a，b），而Fmoc-FFR-OH于pH 5.5、pH 7.2条件下均形成长纤维状结构（图3c，d）. 酶解后另外的产物KFERQ作为生物体内广泛存在的溶酶体信号序列，不具有生物毒性，在本研究中未检测到其组装体形貌.

　　上述研究表明，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH对cathepsin L酶具有高响应性，其酶切产物Fmoc-FFR-OH可自组装形成纳米纤维结构. Yang等［26］指出多肽分子在细胞内自组装形成的纳米纤维结构可以有明显效果地破坏细胞结构，引发细胞死亡. 因此，我们采用MTT法检测了该多肽对正常细胞L929、肿瘤细胞A375以及SH-SY5Y的细胞毒性. 结果为，Fmoc-FFRIKFERQ-OH对正常细胞L929的毒性较小（图4）. 当作用于肿瘤细胞A375和SH-SY5Y时，随着多肽浓度的增加，Fmoc-FFRIKFERQ-OH对A375和SH-SY5Y细胞的杀伤力逐渐增强，当浓度增加至1 mmol/L时，其细胞死亡率分别为63.92%、73.44%，与对照相比，具有非常明显性差异（图4）. 因此，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH对肿瘤细胞A375和SH-SY5Y具有较强的杀伤作用，而对正常细胞具有较低的毒副作用.

　　质谱及AFM实验表明，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH能够被溶酶体内的cathepsin L降解. 接下来，我们通过流式细胞术以及荧光染色实验检测多肽分子加入后细胞内溶酶体结构的变动情况. Lyso-Tracker Red能穿越细胞膜，高选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，以此来实现对于溶酶体的特异性荧光标记. 对照组细胞染色后，溶酶体荧光强度较强（图5d），此时细胞伸展为梭形，紧密地贴壁在孔板的底部（图5a）. 当加入0.5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH时，部分细胞变圆（图5b），细胞内溶酶体染色的荧光强度降低（图5e）. 当Fmoc-FFRIKFERQ-OH浓度继续增加至1 mmol/L，溶酶体荧光强度基本消失，此时大部分细胞形态发生皱缩，且从细胞培养板板底脱离（图5c）. MTT根据结果得出，该多肽浓度下，SH-SY5Y细胞的存活率仅为26.56%，表明大部分细胞已死亡.流式细胞仪结果为，对照细胞内，溶酶体红色荧光的阴性率为5.23%，说明绝大多数的溶酶体结构是完整的. 当细胞与0.5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH温育48 h后，细胞红色荧光的阴性率为16.60%，说明有部分细胞的溶酶体遭到破坏，当将Fmoc-FFRIKFERQ-OH的浓度增加到1 mmol/L，细胞红色荧光的阴性率升高为33.30%，说明大部分肿瘤细胞内溶酶体结构遭到破坏（图5g~i），该实验结果说明，Fmoc-FFRIKFERQ-OH多肽可通过诱导溶酶体破裂达到杀伤肿瘤细胞的目的. 而此浓度下MTT结果为细胞死亡率为73.44%，表明Fmoc-FFRIKFERQ-OH不仅通过溶酶体破坏途径杀伤肿瘤，而且还存在别的诱导肿瘤细胞死亡的途径.

　　肿瘤治疗一直以来都是人们需要攻克的难题，而近年来肿瘤耐药性的出现使肿瘤治疗更加困难. 原位自组装多肽能够靶向性地聚集在肿瘤部位，借助肿瘤部位局部温度高、pH低以及某些生物酶高表达等微环境进行原位自组装形成特定的纳米结构，与肿瘤细胞内维持细胞形态的微管蛋白等结合，影响细胞的增殖和迁移，在肿瘤的精确定位和靶向治疗方面表现出优异的效果［9-10，27-28］.

　　溶酶体作为细胞的“自杀包”，调控肿瘤细胞的发生和发展，可作为肿瘤治疗的靶点［29］. 本文依据多肽原位自组装的设计理念，将溶酶体靶向序列与cathepsin L的酶促反应专一性结合起来，设计了可靶向溶酶体的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，该分子在中性条件下自组装形成尺寸较小的短棒状纳米结构（图3），可通过细胞内吞的方式进入肿瘤细胞内部（图6，Ⅰ），然后在溶酶体靶向序列KFERQ的指引下到达溶酶体（图6，Ⅱ）. 溶酶体内高活性的cathepsin L专一性地识别Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子内R↓I间的肽键，生成Fmoc-FFR-OH产物分子，而该分子可在酸性条件下自组装形成长的纳米纤维（图3），当溶酶体内Fmoc-FFR-OH的含量达到一定阈值（图6，Ⅲ），溶酶体膜溶胀，诱导肿瘤细胞程序性坏死（图6，Ⅳ）. 与肿瘤细胞相比，正常细胞中溶酶体数量远低于肿瘤细胞，因此Fmoc-FFRIKFERQ-OH对正常细胞表现为较低的毒性.

　　肿瘤的靶向治疗已成为未来肿瘤治疗的主要方向和突破口，原位自组装多肽因其独特性质在肿瘤治疗中呈现出巨大的优势和潜能，可利用肿瘤组织特异性高表达的成分诱导多肽在肿瘤部位聚集并发生原位组装，形成稳定的纳米结构，一方面克服了肽分子在细胞内的不稳定性，另一方面也增加了肽分子在局部组织的聚集，降低了对正常组织的毒副作用，进而达到精准治疗肿瘤的目的.