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  我所知道的都是DAB，并且DAB又有许多的办法，包含ABC sABC ，EN VISION 等等，就DAB一种就搞得我目不暇接。我不知道应该用那种办法的试剂盒。现在老板经费足，大胆讨教免疫组化各位高手。DAB的办法那种最好？

  我计划买envison的了，先用dako的试一把，本钱贵但成果牢靠，哎！

  免疫细胞化学中，因为抗原-抗体反响所构成的复合物自身无色，无法直接调查，因而需借助于某些化学基团的呈色效果，使其得以显现，以利于在显微镜下调查。常用的显色液有：

  制造办法：先以少数0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后参加余量TB，充沛摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前参加30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。

  DAB显色液大大都都用在免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产品可直接在光镜下调查，也可经OsO4处理后，添加反响产品的电子密度，用于电镜调查。但有几点需留意：DAB溶解要彻底，不然未溶解的颗粒堆积于标本上影响调查；DAB浓度不易过高，不然显色液呈棕色，添加布景染色，别的DAB有致癌效果，故操作时应戴手套，尽或许的避免与皮肤触摸，用后及时彻底冲刷，触摸DAB的试验用品最好经洗液浸泡24h后运用。

  制造办法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后参加Tb 19ml，用前参加30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时刻一般为5～20min。

  制造办法：先将4-Cl-1-萘酚参加DMF中，加热溶解使呈乳白色，再参加TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后参加H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入安排标本（留意：温度过高易损害标本，过低则易从头呈现沉积）。显色时刻一般为5min左右。

  大都以为最好去除白色沉积（如上述），但Larsson等以为，白色沉积可作为布景，使阳性部位更易调查。因为酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的安排标本，勿用酒精脱水。

  3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液

  制造办法：先将AEC溶于DMF中，再参加醋酸缓冲液充沛混匀。临显色前，参加30%H2O2。切片显色时刻为5～20min。

  该显色液效果后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为布景染色，则效果愈加好。因为终产品溶于酒精和水，故需用甘油封固。

  （1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml参加1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。

  （2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁，加蒸馏水92.5ml混合。

  （3）B液：称取5mg TMB参加2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB彻底溶解。

  （4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充沛混合。（液体在20min内应坚持清亮的黄绿色，不然或许已有污染）。酶反响时，参加终浓度为0.005%的H2O2。

  （5）首要显色过程：安排标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中效果20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）持续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。

  TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因而简单进入细胞与细胞器中的HRP反响，且因为这种高度的脂溶性，使其易构成多聚体，在HRP活性部位发生粗大的、深兰色沉积物，这使得TMB成为组化试验中的一种很好的发色团。一起反响产品的沉积，使得HRP的活性部位愈加露出，利于酶氧化反响进行。TMB的反响产品为深蓝色，利于光镜调查，且反响产品越聚越大，常超出单个细胞器的规模（而DAB则被约束在其内），故TMB反响的检测阈较低。因为上述长处，现在TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研讨。必需要分外留意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜制造。别的，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在或许，故运用时应带手套及在通风条件下操作。

  试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充沛混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。

  B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前康复至室温。

  C．显色液：取A液40μl，参加到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充沛混匀；再参加B液40μl，悄悄混合即可。最好用前新鲜制造。

  NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）效果下，NBT被复原构成显微镜下可见的蓝色或紫色沉积。

  我引荐用EN VISION，咱们试验室用的是福建迈新公司的盒子，质量还不错。当然假如你要是很有钱，无妨用DAKO或是PIERCE。