1、在无菌培育皿或6孔细胞培育板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。再在每片盖玻片上滴加培育液至刚好覆盖满盖玻片。将培育皿（6孔细胞培育板）置于37℃，含5% CO2及饱和湿度的CO2培育箱中培育。

  4)阻断过程：用含5%的正常二度抗体物种来历血清的PBS孵化切片60分钟。（37℃）（一抗前不洗，只甩干）

  5)原始抗体：在切片上吸干剩余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未符号的一度抗体混合一同孵化过夜。当用荧光符号的原始抗体用于直接免疫染色（一度抗体）时，你能够越过用二度抗体的直接免疫染色办法（二度抗体）的过程（6）。（4℃过夜最好）在PBS液或TBS中漂洗3×5分钟。

  6)二度抗体：用一对不同荧光素符号﹡﹡的二度抗体﹡，用以结合相应物种原始抗体的IgG，在室温下孵化切片60分钟，在PBS中漂洗3×5分钟。

  7)复染：假如必要进行核染色如用DAPI（5μg/ml PBS中5min）。在PBS中漂洗切片3×5分钟。

  8)选择性：为了阻挠荧光符号从抗体上脱离，也为了更长的保存以维护染色，在水溶性前言运用前，推荐在含4%甲醛的PBS液中简略的处理（1-3分钟）。在PBS中漂洗切片2×3分钟。

  4、吸除PBS，别离滴加相应的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS液稀释到适宜滴度），置于37℃孵育1h，或置于4℃冰箱中过夜。阴性对相片此步用PBS代替一抗。

  3、倒置显微镜下调查，当细胞增殖到适宜的密度后取出培育皿间断培育（一般为1-3天）。

  4、倾去培育液，加PBS（PH 7.2～7.4）洗刷细胞爬片2次，每次1 min。

  ﹡﹡当用生物素符号的二度抗体时，在进行复染色（过程7）前，应首先用荧光符号的（链）亲和素的ABC技能（见6.2.1章节）来调查生物素。

  1、在细胞爬片上加0.03% Triton X-100水溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省掉）

  5、吸去一抗，PBS漂洗3次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG抗体-fitc多聚体，37℃孵育30min。

  6、PBS漂洗3次，每次5min。新鲜制造DAB显色液，滴加后作用3～5min，置于显微镜下调查染色成果。

  7、双蒸水漂洗后，滴加苏木精染液，染色10min。(1-2分钟就够了染得太浅要再染!)

  将硅化玻片放入饭盒（金属），排好次序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培育箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培育箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，作用不错的。

  1)冰冻切片，晒干，4%多聚甲醛固定10～15min。（细胞爬片固定后，以下过程相同）

  2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mMNaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。PBS液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。

  3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省掉），PBS液洗3×5分钟