本发明涉及分子生物学技术和蛋白质学技术领域，主要是涉及一种应用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的考马斯亮蓝快速染色液和染色脱色方法。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)已成为现代生物学研究中重要的技术方法，是对蛋白质进行纯度及含量鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。sds-page电泳易于操作、用途广泛，已成为许多研究领域中一种重要的分析技术，sds-page包括四个主要步骤，即：凝胶制备、电泳、染色、脱色。其中凝胶制备和电泳已有成熟的技术和专用设备，目前，市场常见的用于凝胶染色脱色的产品，主要存在以下缺陷：1)灵敏度和分辨率较低，且脱色时间不容易控制，脱色后凝胶染色结果不容易保存；2)灵敏度较高的硝酸银染色法，其染色步骤复杂，染色过程污染较大，染色所用试剂原料成本比较高；3)荧光染色法和负染法的染色试剂成本比较高，且需要用特殊的仪器进行仔细的检测分析，目前普及和使用率均较低。

  考马斯亮蓝为一种三苯甲烷类染料，可与蛋白质通过范德华力作用形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝染色法以其较高的重复性和灵敏度以及很好的质谱兼容性，成为目前一种使用比较广泛的蛋白质染色方法，其在一些范围内和蛋白浓度呈正比，因此也用于蛋白定量检测。考马斯亮蓝分为g250和r250两种。其中，考马斯亮蓝g250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，且形成有色复合体较为稳定不容易洗脱，常被用于蛋白定量检测，然而其脱色时间比较久、脱色困难，背景较高且较难脱色彻底，长时间的水中脱色容易使凝胶吸水膨胀甚至破碎；考马斯亮蓝r250灵敏度较高但与蛋白质反应比较缓慢，染色脱色耗时较长，染色液中所含的甲醇、异丙醇、乙酸等大量挥发对人体呼吸道等有较大的危害。

  针对上述技术问题，本发明提供了一种低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液及快速染色脱色方法，具有染色液低毒、低刺激、染色脱色时间短、染色分辨率和色牢度高等优势。

  1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝g-250，加入30-50ml的无水乙醇或异丙醇搅拌至溶解完全；

  3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸或85％磷酸搅拌均匀；

  本发明在前述的低毒低刺激的考马斯亮蓝快速染色液基础上，同时提供一种快速染色脱色方法，所述快速染色脱色方法有如下步骤：

  2)取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水加热煮沸3-5min，完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；

  优选地，所述凝胶在进行步骤1)的染色之前，先加入超纯水清洗凝胶，再次加入超纯水加热至沸腾后取出凝胶并沥干凝胶上的水分。

  优选地，步骤1)中，将凝胶放入有盖耐热容器后加入考马斯亮蓝快速染色液使其完全覆盖凝胶表面，再使用微波炉中高火加热煮沸2-3min。

  1.较传统的考马斯亮蓝染色法的成本低，分辨率比较高，在保证染色效果同时染色液中所含的有毒和刺激性成分更低，同时染色脱色时间快速缩短，传统方法染色脱色约2-3h，本染色液和染色方法最快10min可初步观察结果，彻底脱去背景色总用时约1.5h。

  2.本染色液较目前市场上的快速染色液，染色脱色时间相同，但染色分辨率和色牢度更高，同时染色液成本仅为市场上的快速染色液的十分之一。

  图1(a)为本发明含有质量体积百分数0.005％考马斯亮蓝ccb-g250的染色液的染色结果；图1(b)为本发明含有质量体积百分数0.02％考马斯亮蓝ccb-g250的染色液的染色结果；图1(c)为本发明含有质量体积百分数0.1％考马斯亮蓝ccb-g250的染色液的染色结果。

  图2(a)为本发明含有乙醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图2(b)为含有甲醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图2(c)为含有异丙醇的考马斯亮蓝染色液的染色结果。

  图3(a)为本发明不含硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图3(b)为含有2.5‰硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果；图3(c)为含有5‰硫酸铜/三氯化铬的考马斯亮蓝染色液的染色结果。

  图4(a)为市售某品牌快速染色液电泳结束后立即染色结果；图4(b)为市售某品牌快速染色液染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果；图4(c)为本发明考马斯亮蓝快速染色液电泳结束后立即染色结果；图4(d)为本发明考马斯亮蓝快速染色液染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果。

  图5(a)为传统考马斯亮蓝染色效果(r250)的染色结果；图5(b)为市售某品牌快速染色液的染色结果；图5(c)为本发明考马斯亮蓝快速染色液的染色结果。

  图6为采用本发明的考马斯亮蓝快速染色液染色的一种重组蛋白亲和层析纯化结果。

  图7为采用本发明的考马斯亮蓝快速染色液染色的另一种重组蛋白亲和层析纯化结果。

  为了使公众能充分了解本发明的技术实质和有益效果，申请人将结合实施例对本发明做进一步详细描述，但申请人对实施例的描述并非对技术方案的限制，任何依据本发明构思作形式而非实质的变化都应当视为涵盖在本发明的保护范围之内。

  1)称取0.05-0.2g的考马斯亮蓝g-250，加入30-50ml的无水乙醇搅拌至溶解完全；

  3)加入10-50ml的冰乙酸搅拌至均匀，然后加入10-50ml浓盐酸(也可采用85％磷酸，效果相同)搅拌均匀；

  4)加入超纯水定容至1l，采用10000rpm高速离心5min(也可使用普通定性滤纸负抽滤的方式，对最终结果无影响)去除沉淀后就可以获得染色液。

  1.清洗：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出胶板，切割舍弃浓缩胶，加入超纯水清洗凝胶一次，再次加入超纯水微波炉中高火加热至沸腾后取出凝胶；

  2.染色：凝胶尽量滤干水分，放入有盖耐热容器加入快速低刺激考马斯亮蓝染色液，染液需要保证完全覆盖凝胶表面，使用微波炉中高火加热煮沸2-3min；

  3.初步脱色：取出凝胶用超纯水冲洗凝胶表面残留染液(此时在目的蛋白量较大情况下即可初步看到染色条带)，然后加入超纯水使用微波炉中高火加热3-5min即完成初步脱色(此时可以清晰观察到染色蛋白条带，但凝胶背景色并未完全脱净)；

  4.彻底脱色：取出凝胶后加入150mmnacl水溶液，溶液量以完全浸没凝胶且脱色过程中脱色液不坏洒出为度，水平摇床室温50rpm脱色1h即可彻底脱净背景色。

  另，以下实施例中均采用的彩虹180广谱蛋白marker(11-180kd)，pn：pr1910，索莱宝，条带如图8所示。

  考马斯亮蓝分为r-150、r-250、r-350、g-250等。其中r-350最为灵敏，r为红蓝色，g为绿蓝色。r-250即三苯基甲烷，每个分子含有两个so3h基团，偏酸性，与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。g-250即二甲花青亮蓝，是一种甲基取代的三苯基甲烷，本发明在传统的考马斯亮蓝染色法基础上，将染色较慢考马斯亮蓝r-250替换为染色较快的考马斯亮蓝g-250，在染色过程中有效的缩短染色时间。考马斯亮蓝g-250在一定的ph时，这种染料与蛋白质形成的有色复合物可被完全解聚，对于电泳后蛋白质的质谱鉴定等其他分析有较好的兼容性。

  本实施例用于大肠杆菌融合表达的带有6xhis标签的taqdna聚合酶，大小约为85kda。大肠杆菌诱导表达破碎液，使用pei沉淀核酸和杂蛋白，分别取不同梯度pei沉淀后上清进行sds-page。

  体积为1l的含有不同浓度考马斯亮蓝g-250的考马斯亮蓝快速染色液的三种配方如下：

  染色液中的考马斯亮蓝浓度越高，染色时间越长，其最终染色结果可见的聚丙烯酰胺凝胶中细小蛋白条带更多，灵敏度和分辨率液更高，但同时凝胶的背景色也会随之加深甚至无法脱色完全。通过调整考马斯亮蓝g-250的添加量在0.005％-0.02％之间，可以在保证分辨率前提下，快速缩短染色脱色时间，且保证在使用150mmnacl水溶液作为脱色液脱色1h便可以彻底脱去背景色，如图1(a)-图1(c)所示。

  醇类在染色液中起到固定蛋白的作用，加入醇类等有机成分，能大大的提升凝胶染色的信噪比，使得染色结果背景更加清晰，还能降低染色过程中凝胶表面一些残留物质的干扰。虽然去除染色液中全部醇类成分，染色液同样可保证相同的快速染色效果，但配制过程中溶解染料时间会由原来5-10min延长到60-90min，并且配制完成的染色液室温储存1-2周后底部会出现大量染料沉淀，要延长染色时间才可以做到原有相同染色效果。未使用的不含醇类的染色液在室温保存一个月后会由暗棕色变为深绿蓝色的现象，染色后分辨率下降。

  本实施例用于大肠杆菌融合表达的带有6xhis标签的taqdna聚合酶，大小约为85kda。大肠杆菌诱导表达破碎液，经过热处理，使用进行ni亲和层析纯化，取不同阶段的收集蛋白样品进行sds-page。

  如图2(a)-图2(c)所示，对比加入乙醇、甲醇(传统染色液中使用)，异丙醇(部分快速染色液和优化的染色液配方使用)染色液的染色效果，染色速度脱色速度相当，染色液中醇类含量越高染色速度越快，染色液的稳定性和保质期也会越长，但染色时间过快不利于使用的过程中控制染色时间，有可能会出现过度染色现象这样则要延长脱色时间和步骤，因而溶液中醇类的比例对于染色速度和染色时间有关键影响。

  本发明将现有染色液中的甲醇和异丙醇等有机溶剂替换为低毒低刺激的乙醇，较大程度降低了染色液的毒性和刺激性，乙醇的加入使染料在染色液中溶解性和稳定能力更好，也利于延长染色液保存时间。

  本实施例用于大肠杆菌融合表达的产物带有6×his标签的某种核酸内切酶，大小约为78kda。大肠杆菌诱导表达破碎液，经过dnasei处理后，使用进行heparin亲和层析纯化，取不同阶段的收集蛋白样品进行sds-page。

  如图3(a)-(c)所示，含有不同浓度无水硫酸铜的考马斯亮蓝快速染色液的染色时间没有较大的差异，不加入无水硫酸铜的考马斯亮蓝快速染色液染色凝胶分辨率相比来说较低，同样时间染色脱色，该凝胶背景色较重。5‰无水硫酸铜染色液染色凝胶背景色最低，但目的蛋白下方细小杂蛋白不明显，分辨率相对于2.5‰硫酸铜染色液染色凝胶略低。

  本实施例用于一种大肠杆菌融合表达的带有flag标签的m-mlv逆转录酶，大小约78kda，大肠杆菌诱导表达产物破碎液，使用不相同梯度的硫酸铵进行蛋白的盐析沉淀，取不同梯度硫酸铵沉淀蛋白的重悬液进行sds-page。

  电泳结束后立即按照染色液操作进行快速染色脱色(染色液配方采用配方1)，完成后使用凝胶成像系统拍照，然后凝胶浸泡于纯水中，每天换水一次，72h使用凝胶成像系统拍照；市售某品牌快速染色液电泳结束后立即染色结果如图4(a)所示，染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果如图4(b)所示；本发明考马斯亮蓝快速染色液电泳结束后立即染色结果如图4(c)所示，染色完成后纯水浸泡72h、每天换水一次后的染色结果如图4(d)所示。

  由图中可见，本发明染色液的另外一大优点则是染色快脱色时间短分辨率比较高色牢度较好，凝胶脱色后结果可保存三天以上，优于目前市场的考马斯亮蓝快速染色产品。

  本实施例用于某种大肠杆菌融合表达的醛缩酶，带有mbp标签(大小40kda)目的蛋白大小约45kda。分别在6个不同的大肠杆菌中做诱导表达，大肠杆菌诱导表达产物破碎液15000rpm，4℃，30min离心去除细胞碎片，取不同宿主菌诱导表达产物破碎液上清进行sds-page。

  如图5(a)-图5(c)，在30min，快速完成染色脱色操作，显而易见本发明染色液(采用配方1)和市售某品牌快速染色液条带清晰，背景较低，传统考马斯亮蓝染色效果(r250)染色结果分辨率较低，背景颜色较重，影响条带辨识。

  本应用例用于某种大肠杆菌融合表达的醛缩酶，带有mbp标签(大小40kda)目的蛋白大小约45kda。大肠杆菌诱导表达产物破碎液15000rpm，4℃，30min离心去除细胞碎片，使用进行亲和层析纯化，取不同阶段收集的蛋白样品进行sds-page。使用配方2在30min内，快速完成染色脱色操作，显而易见本发明染色液(采用配方1)背景较低，分辨率比较高，条带清晰锐利，但带有一定背景色，如图6所示。

  本应用例用于某种大肠杆菌融合表达的转座酶，带有intein标签，蛋白大小约55kda。大肠杆菌诱导表达产物破碎液15000rpm，4℃，30min离心去除细胞碎片，使用进行亲和层析，疏水层析后收集获得的目的蛋白混合液，使用进行阴离子交换层析(q柱)，取不同阶段收集的蛋白样品进行sds-page。

  使用配方2对凝胶在30min，快速完成染色脱色操作后，将初步脱色后的凝胶放入150mmnacl水溶液中，水平摇床50rpm/min室温脱色45min，彻底脱色后可见凝胶条带清晰锐利，分辨率较好，如图7所示，也相比单一的快速脱色的凝胶(见图6)背景低，条带更加清晰。

  传统的考马斯亮蓝染色液使用乙酸维持染色液的ph，也辅助蛋白在凝胶中的固定。在酸性环境下考马斯亮蓝更容易与蛋白结合形成稳定有色物。较高的乙酸含量若使用加热的快速染色方法，大量乙酸受热会产生大量刺激性气体，对环境造成污染也危害使用者身体健康。使用盐酸或磷酸(bradford染色液中使用)全部代替染色液中乙酸，能够达到相同快速染色效果，但脱色时间会相比含有乙酸的染色液大幅度的降低，脱色完全后凝胶中较为细小的蛋白条带就变得不清晰甚至消失。因此本发明在维持快速染色液体系固有ph值的同时，并没用盐酸或磷酸全部替代乙酸，只是降低了染色液中乙酸的用量，加入部分盐酸或磷酸代部分替乙酸，使得染色液适用于快速染色方法。通过改变酸和醇的种类和用量，在保证分辨率和染色效果的同时大幅度的降低了染色液的刺激性和毒性，使得本发明的染色液可完全在无通风橱的普通生化实验室中使用。

  本发明染色液的另外一大优点则是染色快脱色时间短分辨率比较高色牢度较好，凝胶脱色后结果可保存三天以上，优于目前市场的考马斯亮蓝快速染色产品。部分考马斯亮蓝染色液配方会加入一定浓度的可溶性淀粉或者硫酸铵等离子，使得染色液中着色剂形成胶体染色颗粒，凝胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高脱色时间能大幅度的降低。本发明的染色液中加入微量的铜离子或铬离子，加入的离子使得染料形成胶体，提高染色效率降低脱色时间的同时，铜离子和铬离子也能和染料-蛋白质的非共价复合体形成更稳定的不溶物，从而使得本染色液的色牢度更好，电泳结果至少可在纯水中保存3天。